DB2305∕T 020-2024 牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程(双鸭山市)
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文件大小(MB)： |
0.27 |
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8 |
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日期： |
2024/9/20 |
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ICS 65.020.30,CCS B 41 DB 2305,双鸭山市地方标准,DB2305/T 020—2024,__________________________________________________________________________________________,牛病毒性腹泻病毒PCR 检测规程,2024-08-20 发布2024-09-20 实施,__________________________________________________________________________________________,双鸭山市市场监督管理局发布,DB2305/T 020—2024,目次,前言Ⅱ,1 范围 1,2 规范性引用文件1,3 术语和定义 1,4 缩略语 1,5 主要仪器设备 1,6 试剂 2,7 样品的采集与处理3,7.1 样品采集 3,7.2 样品处理 3,8 样品病毒核酸RNA 提取3,9 PCR 扩增3,9.1 引物 3,9.2 反应条件 4,10 结果判定 4,10.1 检测结果成立条件 4,10.2 结果判定 4,11 实验室无害化处理 4,11.1 病料的无害化处理 4,11.2 实验室废弃物处理 4,11.3 实验室分区 4,11.4 实验室生物安全管理 4,DB2305/T 020—2024,II,前言,本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由双鸭市农业农村局提出并归口,本文件起草单位：双鸭市农业技术综合服务中心、双鸭山市基本建设项目服务中心、黑龙江农业职,业技术学院,本文件主要起草人：王宇婷、白鹭、刘云、张红军、杜航、张荣翔、秦藕菊,DB2305/T 020—2024,1,牛病毒性腹泻病毒PCR 检测规程,1 范围,本文件规定了牛病毒性腹泻病毒PCR 检测方法的主要仪器设备、试剂、样品采集与处理、样品病毒,核酸RNA 提取，PCR 扩增、结果判定、实验室无害化处理等技术要求,本文件适用于牛病毒性腹泻病毒PCR 检测,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本,文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,GB 19489 实验室生物安全通用要求,SN/T 1193 基因检验实验室技术要求,NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范,3 术语和定义,本文件没有需要界定的术语和定义,4 缩略语,下列缩略语适用于本文件,BVDV：牛病毒性腹泻病毒,PCR：聚合酶链式反应,RNA：核糖核酸,cDNA：与信使RNA 链呈互补的碱基序列的单链DNA,PBS：磷酸盐缓冲液,EP 管：微量离心管,DEPC：焦碳酸乙二酯,EDTA：乙二胺四乙酸,PrimeSTAR Buffer：聚合酶的缓冲液,dNTP Mix：脱氧核糖核苷三磷酸混合液,DNA Polymerase：高扩增效率的PCR 用的DNA 聚合酶,ddH2O：双蒸水,5 主要仪器设备,5.1 二级生物安全柜,5.2 台式高速冷冻离心机：可控温至4 ℃，转速12000 r/min 以上,5.3 冰箱：2 ℃～8 ℃、-20 ℃、-70 ℃三种,5.4 单道（或多道）微量移液器（10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）,5.5 PCR 仪,DB2305/T 020—2024,2,5.6 涡旋振荡器,5.7 电泳仪,5.8 水平电泳槽,5.9 凝胶成像系统,5.10 全自动高压灭菌锅,5.11 电子天平：精密度0.001 g,5.12 通风橱,5.13 pH 计,6 试剂,6.1 在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682 三级水要求。所用液体试剂均需使用,无RNA 酶的容器进行分装,6.2 TRIzol、氯仿、异丙醇（-20 ℃），均为商品化试剂,6.3 无水乙醇，应于-20 ℃预冷,6.4 DNA 相对分子质量标准物Marker DL2000,6.5 75%乙醇：量取75 mL 无水乙醇，加入25 mL0.1%DEPC 水，应于-20 ℃预冷,6.6 0.1%DEPC 水：将0.1 gDEPC 加100 mL 三级水中，充分振荡后作用12 h，121 ℃高压灭菌30 min,冷却后冷藏备用，在通风橱中配制,6.7 30%甘油磷酸盐缓冲液：甘油30 mL，氯化钠（Nacl）4.2 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g，磷酸氢二,钾（K2HPO4）3.1 g，0.02%酚红1.5 mL，加三级水定容至100 mL，加热熔化，校正Ph 为7.6，121 ℃高,压灭菌15 min，4 ℃保存备用,6.8 50×TAE：称取242 gTris、37.2 gNa2EDTA2H2O 溶于800 mL 三级水中，充分搅拌混匀，加入,57.1 mL 的冰乙酸，充分混匀，加三级水定容至1 L，室温保存,6.9 1×TAE：取20 mL 50×TAE，加三级水定容至1 L，室温保存,6.10 cDNA 合成：反转录试剂盒,6.11 10 mg/mL 的溴化乙锭溶液：三级水100 mL，溴化乙锭1 g，置棕色容器中搅拌数小时以确保完全,溶解，用铝箔包裹容器，保存于室温,6.12 0.01 mol/mLPBS：氯化钠（Nacl）8 g、氯化……
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